FISH PCR NGS 這些主流伴隨診斷技術(shù)的區(qū)別到底在哪里？
隨著基因組學(xué)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）、高通量測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）這三種伴隨診斷技術(shù)逐漸成為精準(zhǔn)醫(yī)療、遺傳學(xué)研究和疾病診斷中不可或缺的角色，極大地推動(dòng)了遺傳病診斷、腫瘤基因檢測(cè)和個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展。那這幾種檢測(cè)方式到底有何異同？同樣是檢測(cè)基因異常突變，為何樣本類型、價(jià)格、檢測(cè)周期能差那么多？本期，就讓我們一起來(lái)領(lǐng)教一下這幾個(gè)“基因偵探”的獨(dú)門(mén)技藝吧。
FISH：熒光標(biāo)記下的染色體秘密
FISH是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測(cè)特定DNA或RNA序列的存在。它的原理是利用帶有熒光的標(biāo)記探針與目標(biāo)DNA或RNA序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察來(lái)確定目標(biāo)序列的位置和數(shù)量。FISH技術(shù)在臨床上主要用于染色體分析，如產(chǎn)前診斷、腫瘤診斷和遺傳病分析等。它的優(yōu)點(diǎn)包括高度的特異性和定位準(zhǔn)確性，能夠檢測(cè)到基因擴(kuò)增、缺失及重排等情況，而且實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果。不過(guò)，F(xiàn)ISH技術(shù)的局限性在于它通常只能檢測(cè)有限的染色體或基因，且對(duì)樣本的要求較高，可能受到樣本質(zhì)量和檢測(cè)條件的限制。
PCR：擴(kuò)增的魔法
PCR是一種用于放大擴(kuò)增特定 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可以看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制，其最大特點(diǎn)是能將微量的 DNA 大幅增加。在存在 DNA模板、引物、dNTPs、適當(dāng)緩沖液 (Mg2+) 的反應(yīng)混合物中，在熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶的催化下，對(duì)一對(duì)寡核苷酸引物所界定的核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，這種擴(kuò)增是以模板 DNA與引物之間的變性、退火、延伸三步反應(yīng)為一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目標(biāo) DNA 片段得以擴(kuò)增。
一代PCR
不過(guò)一代PCR也有一定的的局限性：
①一代 PCR 采用的核酸燃料對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境造成較大傷害；
②PCR 完成之后開(kāi)蓋檢測(cè)易污染造成假陽(yáng)性結(jié)果；
③檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且操作麻煩易出錯(cuò)；
④只能做定性檢測(cè)。
因此，二代PCR才是目前國(guó)內(nèi)PCR技術(shù)主流
二代PCR即熒光定量PCR技術(shù)（Real-Time PCR），也叫做 qPCR，是指通過(guò)應(yīng)用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針(如 Taqman Probe)，在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)的定性和定量分析。目前，qPCR常用于傳染病病原體檢測(cè)、疾病耐藥基因研究、藥物療效考核、遺傳疾病診斷等。
二代PCR
隨著 PCR 系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展已經(jīng)對(duì)檢測(cè)，一種具備較高靈敏度和特異性的數(shù)字PCR 技術(shù)開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床檢測(cè)和科學(xué)研究中。數(shù)字PCR（Digitai PCR， dPCR）是一種新興的核酸檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)將每個(gè)核酸分子分配到一個(gè)獨(dú)立的空間內(nèi)，避免選擇性擴(kuò)增對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的干擾，可實(shí)現(xiàn)核酸模板絕對(duì)定量、稀有突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異、DNA 甲基化、基因重排等檢測(cè)功能。由于數(shù)字 PCR 可以實(shí)現(xiàn)直接定量分析，被稱為第三代 PCR。
三代PCR
標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)微滴發(fā)生后，分配到約~30000個(gè)微滴中，每個(gè)微滴包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子（DNA模板），實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后含有核酸分子模板的微滴會(huì)給出熒光信號(hào)，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例，分析軟件可計(jì)算給出目的分子的濃度或拷貝數(shù)。
在醫(yī)藥方向，數(shù)字PCR常用于腫瘤研究、傳染性疾病研究（細(xì)菌、真菌、病毒、支原體）、NIPT、器官移植監(jiān)控、干細(xì)胞研究、移植監(jiān)控、藥物基因組學(xué)開(kāi)發(fā)、生物標(biāo)志物開(kāi)發(fā)、藥物生產(chǎn)質(zhì)控等。
一、二、三代 PCR 的技術(shù)優(yōu)劣
NGS：海量數(shù)據(jù)的解讀者
NGS（高通量測(cè)序）也稱為二代測(cè)序，是一種能夠同時(shí)對(duì)大量DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序的技術(shù)。它通過(guò)模板 DNA 分子的化學(xué)修飾，將其錨定在納米孔或微載體芯片，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，在 DNA 聚合酶鏈反應(yīng)或 DNA 連接酶反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)采集熒光標(biāo)記信號(hào)或化學(xué)反應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)堿基序列的解讀，一次性可完成幾十萬(wàn)至上百萬(wàn)序列的測(cè)定。與傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序相比，NGS具有更高的通量和更低的成本，能夠快速生成海量的基因組數(shù)據(jù)。
NGS的核心原理是邊合成邊測(cè)序，即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列，在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，尤其在疾病關(guān)聯(lián)研究、個(gè)性化醫(yī)療和癌癥診斷等方面展現(xiàn)出巨大的潛力。目前NGS主要應(yīng)用在腫瘤早篩與診斷、生殖遺傳、感染病原體確診與耐藥檢測(cè)、科學(xué)研究等。
結(jié)語(yǔ)
在比較FISH、PCR和NGS這三種技術(shù)時(shí)，我們可以看到它們各自的優(yōu)勢(shì)和局限性。FISH技術(shù)在定位和分析染色體異常方面表現(xiàn)出色，但其檢測(cè)范圍有限；PCR技術(shù)適用于快速擴(kuò)增特定DNA片段，但在復(fù)雜樣本中的應(yīng)用面臨挑戰(zhàn)；NGS技術(shù)則在數(shù)據(jù)產(chǎn)出量和多樣性分析方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，但需要更復(fù)雜的后期數(shù)據(jù)處理。在實(shí)際應(yīng)用中，選擇哪一種技術(shù)往往取決于具體的檢測(cè)需求、樣本情況和可用資源。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和整合，未來(lái)的分子診斷可能會(huì)更多地依賴于這些技術(shù)的組合和優(yōu)化，以達(dá)到更高的準(zhǔn)確性和效率。
